Интересен сей метод анализа вещества (водного) методом флуорометрии.

В частности принципа действия и режимов работы излучателя и детектора, их тип, используемые оптические преобразования.

Кто сталкивался?

Сталкивалась с хромАтографией и флуорИметрией.
Принцип - фл(юо)(уо)ресценция. Вот и читайте про нее.

Мне непонятны следующие моменты:

1. Изменяются ли показания флоурометрии при длительном облучении вещества в статичном состоянии?
2. На какой период необходимо включать облучатель? или он всегда включен?
3. Видел флоурограммы где вместо нанометром по горизонтальной шкале указана временная шкала, как это интерпритировать???

Показания не должны меняться, если само вещество достаточно устойчиво к ультрафиолету и кислороду воздуха. Обычно это так и бывает, посколько долго под облучением его не держат: сняли спектр - излучатель выключили.


Обычно лампу включают перед измерением. УФ-лампа должна сначала "разгореться", чтобы световой поток перестал дрожать. Этим она похожа на лампу дневного света. Обычно это время не больше 5 минут. А если вещество лабильное, то на это время его можно в кюветное отделение не ставить.
Прописав спектр или повторив несколько раз (для проверки на воспроизводимость), излучатель можно выключить, если нет еще других образцов для съема. Да и вообще ресурс лампы надо беречь, т.к. лампы дорогущие, а срок службы у них заканчивается еще задолго до того, как перестает светиться (начинает дрожать световой поток, что в работе недопустимо).


Эта система еще с тех времен, когда диодных матриц не было, а был только один световой сенсор (типа фотоумножителя). В этом случае решетку или призму поворачивали механически, направляя на сенсор различные длины волн по очереди. Соответственно этому, спектр получали путем сканирования/развертки по времени. Обычно временную шкалу калибруют, предварительно снимая спектры с веществ, у которых спектр люминсценции известен.

P.S. Картинка не совсем соответствует действительности, т.к. люминисценцию обычно фиксируют не на проходе, а под прямым углом к падающему свету, чтобы свет от лампы не мог попасть на сенсор напрямую при отсутствии кюветы или через нее.

Ксения все отлично объяснила. Только я в этом случае думаю, что регистрируется излучение на одной длине волны и видят выход нужного (светящего) компонента из колонки от времени.

Ксения! Огромное человеческое благодарю! Просто и понятно!

Хочу попробовать вместо дорогих ламп попробовать лазер 405nm или светодиод 365nm.


Вопрос: Как из заданного диапазона количественного определения вещества (например надо измерять в рамках 100ppb - 100ppm) выбрать разрешение матрицы детектора?

Вы, вероятно, путаете разрешение с чувствительностью. Что касается разрешения, то это разница в длине волны (обычно в нм) соседних диодов в диодной матрице (diode array). Эта величина определяет величину шага по горизонтальной шкале (т.е. дискретизацию спектра). Иными словами, детекция с помощью диодной матрицы при неподвижной решетке вынуждает довольствоваться спектром не в виде непрерывной функции, а заданной по точкам с каким-то фиксированным шагом.

В тех случаях, когда там не диодная матрица, а один единственный диод или фотоумножитель, а решетка поворачивается механически, то разрешение определяет люфт этой механики. Обычно этот люфт гораздо сильнее определяет предельно достижимое разрешение, нежели частота оцифровки сигнала от сенсора.

Таким образом, разрешение является характеристикой прибора, отражающую его способность различать две соседние длины волны. От количества вещества этот параметр не зависит. Точно так же он не зависит от чувствительности прибора, т.е. от его способности регистрировать свет слабой интенсивности.

В данном случае мы имеем две разные характеристики прибора, которые имеют аналогию с цветовым зрением: разрешение - как способность различать цвета (число цветовых градаций в спектральной области), и чувствительность - как способность различать яркость (число градаций яркости).

В случае использования диодной матрицы в качестве детектора разрешение обычно определяется числом диодов. Чаще всего диоды расположены с шагом 1 или 2 нм, а самих диодов в линейке 128 или 256 штук. Например, при 256-ти диодах в линейке и шаге в 1 нм, можно представить спектр в интервале от 400-656 нм, что почти полностью перекрывает диапазон видимого света (400-700 нм). Если диодов в линейке только 128 штук, то придется довольствоваться шагом в 2 нм, чтобы тот же диапазон охватить. В связи с широким распространением диодных матриц в цифровых камерах, число диодов в ряду выросло (ради уменьшения размера "зерна"), а потому могут быть доступны диодные линейки с еще большим числом диодов в линии, чем 256. Если это так, то спектр можно было бы измерить еще с меньшим шагом, чем через 1 нм (т.е. более подробно). Однако для спектров люминесценции это большой пользы не принесет, т.к. пики в этих спектрах довольно широкие, а потому и мерить их с мелким шагом большого смысла не имеет.

Что же касается чувствительности (т.е. способности регистратора уловить слабую флюоресценцию от очень разбавленных растворов вещества), то тут фотоумножители сильно превосходят фотодиоды. Хотя технологии по части последних тоже не стоят на месте. Однако фотодиодные матрицы от фотоаппаратов/телефонов обычно чувствительны лишь к достаточно яркому свету, а уже в сумерках работают плохо. Тогда как на поприще люминесценции хотелось бы иметь чувствительность на порядки больше.

Еще осталось невостребованным слово "Хроматография", вынесенное в заголовок. Тогда как случай регистрации люминесценции вытека с хроматографической колонки имеет значительные отличия от случая, когда измеряют спектр раствора вещества, налитого в кювету. Причем, эти отличия сильно затрагивают саму цель, которой добиваются. Чаще всего в проточной хроматографии требуется не спектр, как таковой, а некий признак, отражающий концентрацию вещества в вытеке. А потому ради упрощения задачи с одновременным повышением чувствительности, люминесцентный свет вообще не делят по длинам волн, а детектируют их все вместе. Т.е. исключают из схемы голографическую решетку, а вместо фотодиодной линейки ставят один единственный диод или фотоумножитель. Бывает и так, что для практических нужд вполне достаточно грубо поделить световой поток на красный-зеленый-синий с помощью тривиальных светофильтров, а не добиваться спектрального разрешения в 1 нм. Тем более что на практике хроматографист обычно заказывает на мониторе график только по одной длине волны - той, на которой у его вещества самое яркое излучение. Только на тот график он обычно и смотрит, пока ждет, когда его вещество из колонки выйдет, а всеми остальным длинами волн не интересуется. Ведь у него одна пара глаз, а не 256 .

Таким образом, в хроматографии мы имеем еще и вторую шкалу - временную, отражающую то, как спектр меняется со временем. И причина этого в том, что хроматографист имеет дело не с раствором постоянной концентрации, налитого в пробирку/кювету, а с непрерывным потоком раствора из хроматографической колонки (его я прежде назвала "вытеком"). Сама же эта колонка представляет собой трубку, заполненную адсорбентом (адсорбция обратимая), используемую в качестве "беговой дорожки" для смеси разных веществ. При этом самые быстроходные из них (слабо сорбируемые) вытекают из колонки раньше всех, а самые тихоходные (сильно сорбируемые) могут выползать из нее спустя продолжительное время. Причем всё это время насос качает через эту колонку чистый растворитель, а разделяемая смесь веществ водится одноразово (обычно с помощью укола шприцом в верхнюю часть колонки).

Объем информации в последнем случае представляет собой двумерную матрицу, где каждая строка представляет собой спектр флюоресценции (шкала в нм), а по строкам нарастает время (секунды от момента старта/укола). Хроматографист воспринять всю эту информацию в полном объеме не может, а потому в режиме on-line (пока идет разделение смеси) его обычно интересуют только текущий спектр на данный момент времени (т.е. последний из измеренных) и график яркости на избранных длинах волн (обычно не более трех на одном графике). Однако в off-line режиме (когда процесс хроматографии завершен) он может потребовать из базы данных построить графики на других длинах волн или просмотреть спектр(ы) в какие-то определенные моменты времени (обычно в моменты локальных максимумов интенсивности и отвечающие чистым компонентам, разделенных колонкой).

Впрочем, компьютерная графика способна отобразить и все данные сразу в виде 3D-картины, где по двум горизонтальным осям откладываются нанометры и секунды соответственно, а яркость/интенсивность откладывается кверху. Но толка от этого бывает немного, т.к. в практическом плане интересны лишь отдельные плоские сечения этой 3D-картинки.


Попробуйте . Могу даже предложить схему проточной кюветы (если это для случая хроматографии надо). Это стеклянный (или кварцевый) капилляр с тройником на конце. Сбоку в тройник поступает жидкость с колонки, вытекая через весь этот капилляр наружу, а ко второму соосному с капилляром концу тройника присоединен световод, через которой лазер просвечивает этот капилляр продольно. Регистрация люминесценции производится сбоку от капилляра. В этом случае возбуждающий свет лазера и флюоресцентный свет тоже расположены до 90 градусов, то такая конструкция много лучше, чем подавать свет поперек капилляра, т.к. его круглые стенки будут отражать часть излучения в детектор, минуя флюоресценцию, а это очень плохо. Капилляров квадратного сечения (где отражательный эффект от стенок не проявлялся бы) вам не найти (таких не бывает), а использовать прямоугольную кювету в хроматографии нельзя, т.к. в ней из-за большого объема будет происходить перемешивание, которое непременно разозлит хроматографистов.

Xenia
А как работали до светодиодов?
Хочется более детально узнать. С чертежами, и самое главное названия приборов и комментариями.
Помнится у нас в универе было два спектрографа/хроматографа.
Первый был совсем без электричества.
У второго была лампа, но диодов не было. И его надо было калибровать. Насколько помню вместо датчика определяли по лучу. Если пятно луча большое, то яркость большая. Пятно маленькое яркость маленькая. Я так думаю, не помню точно, должна была быть шкала. И ручку вращали для получения нужной частоты.

С чертажами туго, т.к. флюориметры были сплошь импортными.

До светодиодов был фотоумножитель (об этом я уже говорила).
Причем, в большистве флюориметров не было даже сканирующей развертки, а длина волны устанавливалась вручную, вращая колесико. Такие детекторы назывались "детектором с переменной длиной волны", но сканирующими не были и спектр снимать не позволяли.

Я когда-то работала с такими, но это были не флюориметрические детекторы, а ультрафиолетовые (UV).
Разница между ними невелика: первые мерили интенсивность рассеиваемого света, а вторые - интенсивность света, проходящего через раствор. Таким образом, первые измеряли флюоресценцию, а вторые - прозрачность раствора на данной длине волны. Последние в хроматографии более популярны, т.к. флуоресценция - довольно редкое явление среди химических веществ, а ультрафиолет поглощает большинство из них.

P.S. впрочем, Гуглом (картинки на фразу "флуориметрический детектор") можно найти и чертежи. Например, вот это:

Только вам такую никогда не сделать.

Ксения, подскажите как определить тип флуоресцирующей молекулы зная длину волны облучателя (например 365нм) и длины волн флуоресценции вещества? Может какие то таблицы есть или закон и т.п.?

Флуоресценцию дает обычно сопряженная ароматика (в молекуле более одного ароматического кольца в непосредственной близости друг к другу, обычно "сросшиеся"). В принципе это редкость, если бы не одно но. Дело в том, что одна из 25-ти природных аминокислот, из которых построено все живое, а именно аминокислота "триптофан" обладает флуоресценцией. Благодаря чему, эта же флуоресценция наблюдается практически у всех белково-петидных "вытяжек" из живых организмов. Поэтому-то флуоресцентные детекторы и востребованы там, где хроматографисты выделяют из биологических объектов индивидуальные вещества. А не повезло бы так сильно с триптофаном, но едва ли флуоресцентные детекторы пользовались достаточным спросом, чтобы их производили на продажу.

Следующий случай - когда флюорофор специально к молекуле "пришивают", как маркер. Тогда скопление таких молекул видно даже в (флуоресцентный) микроскоп. Практический пример. Бывают вещества, которые раковые клетки поглощают гораздо сильнее, чем здоровые. Тогда такое вещество маркируют флуоресцентной меткой (химическим путем пришивая флюорофор к хвосту такой молекулы), потом вводят это вещество в культуру тканей, давая раковым клеткам время на его пожирание, а затем смотрят на то, что получилось, в микроскоп с УФ-подсветой. Тогда в поле зрения этого микроскопа раковые клетки станут светиться ярче, чем нормальные. По этому признаку можно даже сосчитать их число (в крови).

Еще бывает, когда флюорофор пришивают к одному из концов ДНК, а потому ферментом рубят эту ДНК в случайных местах. Тогда статистически образуются набор флуоресцирующих отрезков разной длины (отрезки с другого конца не видны, т.к. не светятся). А потом при хроматографии эти отрезки выходят в порядке увеличения длины (самые короткие бегут впереди, а чем длиннее, тем дольше не выходит из колонки). Флуоресцентный детектор вытек из той колонки регистрирует, и получается генетическая последовательность.

Из всего этого следует, что среди практических случаев чаще всего встречаются только два варианта: либо это природные триптофан-содержащие вещества с характерной для триптофана флуоресценцией 300-350 нм, либо искусственно повешен какой-то из интенсивных "стандарных" флюорофоров. Последние всегда есть в каталогах фирм, производящих химреактивы. Там они они обычно перечислены вместе указанием длины волны флуоресценции и ее яркости. Наверняка и в интернете можно найти какие-то списки таких флуорофоров.

Что касается вашей длины волны облучателя (365 нм), но она слишком велика, чтобы возбудить триптофан, т.к. излучатель должен иметь меньшую длину волны, чем длина волны возбуждаемой им флуоресценции (чем короче длина волны, тем больше энергия). Ну, а для промышленных флюорофоров 365 нм возможно годится.

Немного добавлю...
Люминисценция - релаксация возбужденной молекулы (или атома с оговорками...). Возбудить можно разными путями - светом (с большей энергией кванта или многоквантово), электрическим током, как в светодиоде, электронным ударом, химической реакцией и т.п.. Спектр высвечивания, естественно, определяется уровнями основного и возбужденного состояния молекулы. Эти уровни, естественно, определяются строением этой молекулы. Есть специально для этого приборы - спектролюминометры, которые регистрируют спектр излучения в зависимости от длины волны монохроматического возбуждения.

Видимо именно по содержанию данного вещества можно судить о биологическом загрязнении промышленных вод?

Ксения благодарствую за " флюорофор", понял что добавляя его в реагент, можно контролировать содержание реагента в растворах. Это очень интересно!

Вы меня поняли неправильно. Добавляя флюоресцирующий реагент в раствор, вы только его и увидите в том растворе с помощью флюориметра. Точно также, как если бы подсинивали раствор синими чернилами. А то применение в химическом анализе, которое я описала в прошлом своем посте, основано на химической реакции, которую проводят между флюорофором и анализируемым веществом, чтобы их молекулы соединились в одну! И которая бы унаследовала от флюорофора способность светиться в ультрафиолете, а от анализируемого вещества - его физиологические свойства.

Продажные флюорофоры - это вещества с очень интенсивной и зачастую специфической флюоренценцией (спектром). Благодаря своей интенсивности, они во многих случаях применяются аналогично душистой парфюмерии в ... туалетах, чтобы своим интенсивным запахом заглушить запах кала и мочи. . А еще точнее аналогия с красителем, который в виде краски способен замазать ржавое пятно на стене в том же туалете . По этой же причине флюорофоры часто называют "флюоресцентными красителями", что очень точно отражает их природу и свойства. А разница между флюоресцентными и обычными красителями только в том, что обычные необратимо поглощают какую часть спектра падающего на них света, тогда как флюоресцентные что-то еще излучают взамен того, что поглощают. Однако это ничуть не мешает одному и тому красителю одновременно совмещать в себе обе должности - быть красителем одного цвета в проходящих лучах и другого цвете в отраженных. Да и по своей химической природе органические флюорофоры являются типичными красителями. Видели должно быть ядовито-желтые, ядовито-оранжевые и ядовито-зеленые куртки? Так вот именно ими они и покрашены!

Кстати, бывает и так, что к анализируемому веществу "пришивают" не только флюорофоры, а обычный краситель. Только тогда детектор используется не флюорометрический, а обычный UV/VIS (детектор на пропускание УФ и видимого диапазона). Т.е. идея тут совсем простая: если само по себе анализируемое вещество не обладает цветом или флюоресценцией, но его слегка модифицируют, пришивая химическим путем светящуюся метку. Да и сами продажные флюорофоры зачастую специально снабжаются активной ("липкой") группой, которая химически связывается со многими веществами, если их подержать какое-время в одном растворе.


В некоторых случаях можно, только уж больно противно . Дело в том, что флюоресценция, подобно цвету, является хорошей характеристикой только чистых веществ или несложных смесей. В тех же случаях, когда перед нами грязь, разобрать, из чего она состоит, крайне сложно. Например, розовый цвет хорошо виден на лепестках розы, но в ... помёте козы, которая съела эту розу, вы тот розовый цвет едва ли обнаружите даже с помощью оптического детектора. Тоже касается и запаха розы в каловых массах .
К тому же флуоресценция довольно нежная - присутствие других веществ может ее гасить, а не просто заглушать.
Другое дело - в хроматографии, когда колонка делит смесь на индивидуальные вещества, вытекающие из нее в РАЗНОЕ время. Тут уже через детектор проходят растворы разных веществ ПО ОЧЕРЕДИ, а потому цветность (спектры поглощения или флюоресценции) отдельных фракций уже может служить их индивидуальной характеристикой, чем-то вроде опечатка пальцев.

На счет загрязнений нашла в инернете две типичные статьи на эту тему:

http://technomag.bmstu.ru/file/out/504977
http://technomag.bmstu.ru/doc/256187.html
Экспериментальные исследования спектров флуоресценции природных образования и нефтяных загрязнений

http://www.contenant.ru/1electron_mag/pdf/12.pdf
Обработка сигналов в задаче лазерного флуоресцентного контроля нефтяных загрязнений

Рекомендую взглянуть, как паршиво выглядит спектр "грязи". Особенно сырых нефтепродуктов, среди которых встречается собственная флюоресценция.

1. Я хотел сказать что добавляя флюорофор в реагент - получим "помеченный" реагент. Содержание которого(помеченного реагента) теперь можно контролировать например в воде при дозировании.

2. Если в одном флуориметрическом датчике сразу организовать датчик мутности, какую длину волны света лучше использовать?

Муть всегда светится отраженным светом, как ... кольца Сатурна. А потому, измеряя флюоресценцию, детектор должен быть нечувствителен к свету той длины волны, которой он облучает кювету. Т.е. надо постараться, чтобы свет с длиной волны самого лазера не попадал на фотосенсоры, т.к. из-за мутности раствора свет, отраженный от взвешенных в растворе твердых частиц, может ослепить сенсор, лишив его способности к регистрации света слабой интенсивности. Например, фотоумножитель при попадании в него прямого солнечного света может навсегда выйти из строя.

Если же там на пути стоит голографическая решетка, то именно она должна отсеивать исходную длину волны лазера, отправляя ее мимо диодной линейки. Впрочем посмотрите картинку в одной из статей, где на спектре страшно зашкаливает вторая гармоника лазера. А первую они вполне благоразумно даже не пытались регистрировать.

Впрочем, интенсивность отраженного под 90 градусов света с длинной волны лазера, ослабленного каким-нибудь фильтром, вполне можно использовать, как меру мутности. Главное не забывать, что эта интенсивность может на порядки превосходить флюоресценцию, а потому надо изобрести что-то такое, чтобы эту длину волны сильно ослабить по сравнению с остальными. Я бы, пожалуй, детектировала ее отдельным сенсором через светофильтр, а диодную линейку поберегла.

P.S. Почему бы вам вместо лазера не использовать "лазерный диод"? Сама лично их никогда не видела, но многое про них пишут. Они относительно недороги, компактны и УФ- среди них вроде бы встречаются. А большая яркость луча, свойственная лазеру, флюориметру вроде бы не нужна.

Насколько я знаю, лазерный диод есть элемент лазера, что в принципе одно и тоже.

Сейчас я рассматриваю два варианта, это лазерный диод и мощный светодиод. Читал что монохромный источник лучший облучатель для флуориметров.



Изучу данный метод. Изначально думал сделать простым замером прозрачности, поставив отдельный фотодиод напротив облучателя.

[quote name='LexaryStyle' date='Nov 16 2014, 12:35' post='1291898']
Интересен сей метод анализа вещества (водного) методом флуорометрии.

В частности принципа действия и режимов работы излучателя и детектора, их тип, используемые оптические преобразования.

Кто сталкивался?
[/quo
активность водных микроорганизмов исследуют. Чем выше флуоресценция на молекулах белка тем клетка считается "живей". То же - для исследования растений. В красноярском научном центре флуориметры сами изготавливали для подобных исследований.